1、收集樣品
2、相關試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預混試劑)。
3、實驗儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機。
4、總RNA提取
5、cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系?；靹蚝?0℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應條件設置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
6、引物設計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7、實時定量PCR 按以下反應體系進行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴增反應條件設置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環(huán))。
8、PCR產物溶解曲線分析 將所擴增的PCR 產物進行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產物單一，無非特異性擴增產物。溶解曲線生成的反應程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
注意事項：收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定，對收集后當天進行檢測的標本，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復凍融，標本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月，-70度可保存6個月，部分標本需添加抑肽酶。
