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一、實驗目的
通過檢測細胞內(nèi) DNA 含量的變化，檢測外界干預手段對細胞生長周期的影響。

二、實驗原理
細胞周期（cell cycle）：是指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期組成。G0/G1 期：二倍體細胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 開始合成，這時細胞核內(nèi) DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之間。G2/M 期：DNA 復制結(jié)束成為 4 倍體（4N)。

碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 雙鏈螺旋的堿基之間，產(chǎn)生紅色熒光，并且熒光強度和所嵌入的核酸含量成正比。細胞周期檢測時，首先用 RNA 酶將 RNA 消化排除影響，通過流式細胞術(shù)檢測 PI 熒光強度直接反映細胞各時相的 DNA 分布狀態(tài)，從而計算出各時相的百分率。

三、實驗步驟
1. 細胞樣品的準備：待各實驗組細胞融合度達到 70%，用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入含有血清的完quan培養(yǎng)基終止消化，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。
對于懸浮細胞：收集細胞到離心管內(nèi)，1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。
2. 細胞固定：加入 1 毫升冰浴預冷 70% 乙醇，輕輕吹打混勻，4℃ 固定過夜。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預冷的 PBS，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。
3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液，現(xiàn)配現(xiàn)用：

染色：每管細胞樣品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀， 37℃ 避光溫浴 30 分鐘。

流式檢測和分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長 488nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞 DNA 含量分析和光散射分析。

四、常見問題及解答

Q1：是否可以直接用乙醇固定細胞?

A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易導致細胞聚團現(xiàn)象，很難重懸成單細胞，影響固定效果，其至容易導致固定后無細胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是: 待細胞, 充分分散成單細胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為 70～75%7 醇。

Q2：細胞量過少，無法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果?

A：首先，要保證收集足夠的細胞樣品 (個人經(jīng)驗至少收集 100 萬左右): 如果藥物處理后。細胞死亡過多，應該降低藥物濃度；其次，固定細胞時先用預冷的 PBS 重懸細胞，再逐滴滴入無水乙醇中；細胞清洗時，不可過度吹打細胞，以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點，不要吸完。

Q3：什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用?
A：G2/M 期細胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方圖上形成一個 2 倍于 G1 信號峰的高斯峰；CV(變異系數(shù)) 表示峰的寬度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被認可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 則不被認可。RCS 高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預期值的差別比較大，可能由于處理細胞的時候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的濃度不佳造成的。

Q4：如何提高分辨率和精確度?
A：變異系數(shù) (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精確度。而樣品 CV 值為樣品固有，與樣本制備過程中細胞質(zhì)量有關。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA 酶消化越充分，可以減少樣本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精確度。